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上海交通大学 硕士学位论文生物发酵过程仿真软件设计 别：硕士专业：控制理论与控制工程 指导教师：袁景淇 20050401 申请上海交通大学硕士论文 生物发酵过程仿真软件设计 摘 要 计算机仿真技术在生物发酵过程研究中有着重要的意义 本文以毕氏酵母的发酵过程为研究对象 对生物发酵过程的模型建立 模型仿真模型参数辨识和补料策略优化等问题作了详细的阐述 首先在分析了生物发酵过程的常见问题和计算机通用仿真软件在设计上的难点问题的基础上 提出了生物发酵过程仿真软件的通用性设计上面临的几个主要问题 然后根据 LabVIEW 开发环境的相关特点 提出了生物发酵过程仿真软件的通用性设计的总体思路 同时根据需求分析设计了模型输入模块 模型仿真模块 模型参数辨识模块和补料策略优化模块四个主要功能模块 并具体描述了四大主要功能模块设计流程 本文还给出了生物发酵过程通用仿真软件在毕氏酵母的甘油期发酵过程的应用实例 详细地描述了各个功能模块在 LabVIEW6.i 版本上的具体实现 并给出了相关 LabVIEW 的数据流框图 最后本文还给出了通用仿真软件的毕氏酵母的甘油期发酵过程的运行流程和各个功能模块的测试结果 结果证明四大功能模块是能正常运行的关键词 仿真软件 生物发酵过程 毕氏酵母 LabVIEW 开发环境 参数辨识 补料优化 -5- 申请上海交通大学硕士论文 DESIGN OF SIMULATION SOFTWARE OF BIOLOGICAL FERMENTATION PROCESSES ABSTRACT The computer simulation technique plays an important role in thebiological fermentation process. Taking of Pichia pastoris fed-batchfermentation as an example this paper describes the problems of modelestablishment model simulation parameter identification and feed strategyoptimization in bioprocess. Firstly on the basis of the analysis of the common problems in thebiological fermentation process and complicated points in the design of theall-purpose simulation software several questions about the generalavailability design of the simulation software were presented. Then the totaldesign plan of the all-purpose software is brought forward according to therelative feature of the development environment of LabVIEW. Four mainfunctional modules are built up which are model inputing module modelsimulation module model parameter identification module and feed profileoptimization module respectively. Detailed design process is presented. Anexample of the application of the all-purpose simulation software in theglycerol fermentation process of Pichia pastoris is given. Then therealization of those independent functional modules developed by theversion of LabVIEW 6.i is described. Finally the data flow block of thePichia pastoris glycerol fermentation as well as the test result of thefunctional modules are given which proves that the four functional moduleswork effectively.KEY WORDS: Simulation software Biological fermentation process Pichia pastoris LabVIEW parameter identification feeding optimization -6- 申请上海交通大学硕士论文 第一章 绪论1.1 引言 20 世纪 40 年代 随着第一台电子计算机的诞生 出现了一种新的科学研究方法 计算机仿真 computer simulation 方法 即计算机模拟方法 它是指在电子计算机上建立某一现存或虚拟系统的模型 对该系统的结构和行为进行动态仿真 从中得到研究者所需要的信息 并为决策过程提供依据的一种研究方法 计算机仿真方法是仿真方法的一种 仿真方法包括数学仿真 物理仿真和计算机仿真等 经过几十年的发展 现在计算机仿真技术已经成为科学研究和技术开发过程中不可缺少的重要技术手段和工具 现代仿真技术的发展是与控制工程 系统工程及计算技术的发展密切相联系的控制工程和系统工程的发展促进了仿真技术的广泛应用 而计算机的出现以及计算机技术的飞速发展 则为仿真技术提供了坚实的物质基础 建立系统的数学模型并使其能在计算机上进行运转和试验 既经济又方便 因此 计算机仿真在仿真系统占有举足轻重的地位 当然 仿真技术得以发展的最主要的原因是它带来了重要的社会和经济效益 仿真技术可以降低系统的研制成本 对那些费用昂贵 有时甚至无法做到的实验可以通过计算机来模拟完成 如药理实验 手术实验等是无法直接在人身上进行的 化工过程新工艺的开发与放大 装置的改造等等的实验则会耗费较大的财力物力 对于类似航天航空 反应堆和潜艇 连续运行易燃易爆的石油化工过程等系统 仿真技术则可以提高系统实验 调试和训练过程中的安全性 对于社会和经济等非工程领域 仿真技术作为研究系统的必要手段 尽可能避免直接实验 建立模型是仿真的第一步 也是关键 对真实系统建立模型是为了更好地 更深入地研究系统 对计算机仿真而言 也就是建立了计算机能够进行处理的模型形式 称为仿真数学模型 建立计算机数学模型很重要的一点是具有实验的性质 即模型与对象的功能和参数之间应具有相似性和对应性 这种相似关系和对应关系不应被数学演算过程所掩盖 否则就仅仅是一次数值求解而已 此外 通过仿真实验要了解包含于系统变量之间的关系 观察系统模型变化的全过程 为了对仿真模型进行更深入研究和结果优化 还必须进行多次运行 参数优化等工作 因此 仿真模型的建立是一个循环反复的过程 随着生物工程技术的迅速发展 发酵工业的生产设备和规模不断扩大 生产过程对自动控制技术的要求越来越迫切 然而微生物发酵过程不同于一般的过程工业它涉及生命体的繁殖过程 机理十分复杂 加之许多发酵过程信息无法测量 给优化控制带来了极大的困难 为此 最近二十几年 世界各国都十分重视发酵过程的测量 建模和控制的研究开发工作 特别重视计算机在发酵工程中应用研究 正是基于这一背景情况下 作者进行了生物发酵过程的通用仿真软件的开发针对一般生物发酵过程的建模 模型优化和优化控制方面的常见问题 分别设计了 -9- 申请上海交通大学硕士论文相应的功能模块 为生物发酵过程仿真模型的建立 优化和优化控制带来便利和深入研究的可能性1.2 软件开发环境的选择 用于仿真的软件不同于其他软件 因为通常仿真计算会涉及到数学分析及信号处理过程 人们已经开发了多种专门用于仿真的语言 如 GPSS 用于离散系统仿真 SIMAN 用于混合系统仿真 DYNAMO 用于系统动态仿真 一个好的仿真语言应该具有以下特点 可以方便地将仿真任务翻译为程序语言 出色的数据可视化能力 有适合仿真计算的数据结构范围 通过简单的操作即可完成变量计算和参数设置 精心构建于数学分析 信号理论上 与现实世界良好的互联性1.2.1 LabVIEW 开发环境的优势 LabVIEW 集成了丰富而功能强大的数学工具 包括了线性代数 概率统计 最优化 曲线拟合和微积分等常用工具 为用户的编程提供了极大的方便 此外LabVIEW 还具备了强大的图形显示能力 便捷的快速程序设计和硬件驱动能力 因此 LabVIEW 是适用与过程控制和工业自动化应用的一个优秀的开发环境 本软件选择 LabVIEW 开发环境而没有采用传统的其他高级语言如 VB VC Pascal 等主要是基于以下考虑 1 LabVIEW 是一种基于图形编程语言 G 语言 的开发环境 因此在程序设 计中的直观性 可读性和可维护性要比传统高级语言的来的好 2 LabVIEW 提供的 Parser 公式翻译器 是其他高级语言没有的 而 Parser 在本软件的实现过程中得到了广泛的应用 很大程度上提高了软件实现的效 率 3 LabVIEW 的图形显示工具能够使编程人员很方便地完成仿真软件的显示功 能 4 LabVIEW 自身就集成了强大的数学分析和信号处理功能 可以更方便地实 现给定的算法 5 LabVIEW 作为开放的工业标准 提供了各种接口总线和常用仪器的驱动程 序 为本仿真软件的功能扩展提供了可能 - 10 - 申请上海交通大学硕士论文 6 LabVIEW 集成的丰富的函数模块使其在仿真程序化时效率非常高1.2.2 LABVIEW 的简介 LabVIEW 是一种用图标代码来代替编程语言创建应用程序的开发工具 它使用数据流编程方法来描述程序的执行 用图标和连线代替文本的形式编写程序LabVIEW 也是一种带有扩展库函数的通用程序开发系统 其库函数包括数据采集GPIB General Purpose Interface Bus 通用接口总线 和串口仪器控制 数据现实分析和储存等 LabVIEW 是一个通用编程系统 它不但能够完成一般的数学运算逻辑运算和输入输出功能 它还带有专门用于数据采集和仪器控制的库函数和开发工具 尤其还带有专业的数学分析程序包 基本上可以满足复杂的工程计算和分析要求 LabVIEW 环境下开发的程序称为虚拟仪器 VI Virtual Instruments 因为它的外形和操作方式可以模拟实际的仪器 实际上 VI 类似于传统编程语言的函数或子程序 虚拟仪器技术18也是当前测控领域的技术热点 它代表了未来仪器技术的发展方向 工业发达国家已经将虚拟仪器技术广泛应用于航天 通讯 生物医学 地球物理 电子 机械等各个领域 进行工程技术工作和科学研究 国内对虚拟仪器的研究于工程应用也取得了很多成果 在产品性能测试 设备故障诊断 生产过程控制中得到普遍应用 采用虚拟仪器技术构件测试仪器 开发效率搞 可维护性强测试精度 稳定性和可靠性能够得到充分保证 具有很高的性价比 节省投资 便于设备更新和功能转换与扩充1.3 生物发酵过程通用仿真软件的开发背景1.3.1 生物发酵过程 生物发酵工程 也称为微生物工程 是生物技术中重要的组成部分 它是一种给微生物提供最适宜的发酵条件生产特定产品的技术 早期的发酵是厌氧发酵 如酿酒等 现代发酵工业指微生物在好氧与厌氧环境中通过纯种培养获得有用产品的过程 一般来说 生物发酵方式可以分为分批发酵 补料分批发酵和连续发酵等三种类型 1 分批发酵又称分批培养 是指一个密闭系统内投入有限营养物质后 接入 少量的微生物菌种进行培养 使微生物生长繁殖 在特定的条件下只完成 一个生长周期的微生物培养方法 在分批发酵过程中 随着微生物细胞和 底物 代谢物的浓度不断变化 微生物的生长可分为停滞期 对数生长期 稳定期和死亡期等四个阶段 2 补料分批发酵是在发酵过程中 间歇或连续地补加新鲜培养基方案方法 - 11 - 申请上海交通大学硕士论文 又称半连续培养或半连续发酵 是介于分批发酵和连续发酵之间的一种过 度发酵方式 目前用于补料分批发酵的主要有单细胞蛋白 氨基酸 抗生 素 维生素 酶制剂 有机酸以及有机溶剂等生产过程 由于目前补料分 批培养的类型很多 分类比较混乱 尚未有统一的分类方法 3 连续发酵是指以一定的速度向培养系统中添加新鲜的培养基 同时以相同 的速度流出培养液 从而使培养系统内培养液的液量维持恒定 使微生物 细胞能在近似恒定状态下生长的微生物培养方式 它与封闭系统中的分批 培养方式相反 是在开放的系统中进行的培养方式 一般的生物发酵反应 可以用下图的流程来表示 空气 二氧化碳等 细胞或酶等生物催化剂 除菌 检测和控制 生物反应器 冷却水 灭菌 产品预处理 原材料 培养基 废物 产品提取和纯化 产物 副产物 废物 图 1-1 生物发酵反应流程 Figure 1-1 Biological fermentation reaction process1.3.2 毕氏酵母的特点和发酵过程 面包酵母表达系统在技术上已经比较成熟 并广泛应用于遗传工程研究中 但是采用面包酵母作为宿主有以下缺点 重组蛋白生产的水平较低 质粒不稳定 重组蛋白的超糖基化 Buckholz and Gleeson 1991 最近的研究表明 毕氏酵母表达系统在异源蛋白的分泌表达方面优于面包酵母 例如 含有单拷贝乙型肝炎表面抗原编码基因的重组毕氏酵母可生产0.4 g L-1 的重组抗原蛋白 而面包酵母必须拥有50 多个基因拷贝才能达到相同的产量 张惠展 2000 Clare et al. 1991比较了重组毕氏酵母和面包酵母在高细胞密度状态下表达和分泌鼠表皮生长因子 mEGF 的能力 培养含有19 个mEGF 基因拷贝的毕氏酵母 最终可获得450 mg -1L 的重组蛋白 而培养面包酵母所获得的最高蛋白表达水平仅为6 7 mg L-1 毕氏酵母作为宿主的优势有很多 其中最为重要的是以下六点 Cereghino and - 12 - 申请上海交通大学硕士论文Cregg 2000 Romanos 1995 1 AOX1 有强的启动子 适合外源基因的调控表达 2 容易高密度发酵 放大生产 3 异源蛋白的表达量高 并能分泌到胞外 4 毕氏酵母表达系统的基因调控技术与面包酵母表达系统有很大的相似性 而后者的研究已经比较成熟 因此 可以从中借鉴很多技术方法 5 与面包酵母相比 毕氏酵母对异源蛋白产物的糖基化方式更接近高等生物 因而临床应用更安全 6 不产生毒素 因此表达用于医药和食品行业的重组蛋白时安全性好 毕氏酵母的发酵过程包括甘油期和甲醇期 甘油期的目的是实现细胞高密度培养 过程始于甘油间歇发酵 16 小时后 培养基内基质耗尽 表现为溶氧浓度急速上升 这时开始流加甘油 甘油流加发酵持续 14 16 小时 甘油期结束时细胞干重可达 75 g L 1 左右 甲醇期包括 10 小时的诱导期和 120 160 小时的产物生成期甲醇诱导初始阶段 AOX 的活性很低 为了避免过高的甲醇积累 故诱导期的补料速率较低 整个过程通过流加氨水控制 pH 6.5 氨水同时为微生物提供氮源 另外 甘油期每隔 4 小时进行一次采样 甲醇期的采样间隔则是 8 小时1.4 作者的工作内容和章节安排 本文以重组毕氏酵母发酵生产人血清白蛋白为参考背景 进行通用生物发酵过程仿真软件的开发和测试 作者通过对重组毕氏酵母发酵过程建模 模型仿真 模型参数优化和补料策略优化这些常见问题的了解和研究 采用 LabVIEW 开发环境设计了通用的生物过程仿真软件 并对其中的相应模块进行了测试 第二章讲述了软件的模块的通用性的设计思想 并给出了各个模块的具体设计和相应的端口 第三章给出了通用仿真软件在毕氏酵母发酵过程中的应用实例 并且给出了各个模块在 LabVIEW6.i 版本开发环境上的具体实现 第四章为通用仿真软件的测试和结果分析 在第五章对本文工作进行了总结和展望 - 13 - 申请上海交通大学硕士论文 第二章 生物发酵过程的通用软件的实现流程和模块设计2.1 生物发酵过程的仿真软件的通用性设计 结合生物发酵过程的特点和通用仿真软件设计中的难点 提出了软件的通用性设计中需要解决的几个主要问题 1 过程模型的通用性 本软件的设计是可以适用于不同的生物发酵过程 对 不同的测量和分析数据 包括连续测量的补料速率以及离线分析数据等 软件都能实现不同过程的仿真 模型参数的辨识和操纵变量的优化等功能 2 各个独立模块的通用性 即软件设计中的各个功能模块的接口设计是适合 于一般的生物发酵过程的 一般的生物发酵过程在进行计算机的仿真时 都需要进行模型的仿真 模型参数的辨识和补料的优化控制等 3 算法模块的通用性 例如模型仿真模块的接口设计上 由于生物发酵过程 背景的复杂性和对仿真精度的不同需求 因此仿真算法应该是可以被替代 的 基于以上对软件通用性设计的分析 本文利用了 LabVIEW 开发环境的优势给出了仿真软件的通用性设计思路 1 过程模型的输入问题是通用性设计的难点 这是由于过程模型的形式的多 样性所造成的 因此要解决这个问题 首先必须要对过程模型的形式进行 标准化 生物发酵过程是时变 非线性 多变量输入输出 有一定随机性 的动态过程 其机理和过程虽然非常复杂 但基于发酵过程的可模型化这 个前提 但经过一系列的抽象和简化 作者给出了描述一般生物发酵过程 模型的数学模型标准 从而为模型的输入提供可标准化的模板 2 在各个功能模块的设计时 考虑了一般生物发酵过程的特点 针对一般生 物发酵过程在进行计算机仿真时的常见问题设计几个主要的功能模块 包 括系统模型输入模块 模型仿真模块 模型参数辨识模块和补料优化模块 3 为了解决算法模块的可替换性需求时 在进行模型仿真模块 模型参数辨 识模块和补料优化模块设计中 把算法部分的程序单独提出作为一个独立 的模块 从而实现了算法的模块化设计 - 14 - 申请上海交通大学硕士论文2.2 生物发酵过程的通用仿真软件的实现流程 生物发酵过程是时变 非线性 多变量输入输出 有一定随机性的动态过程其机理和过程虽然非常复杂 但通过一定的机理分析和建模方法 再通过一系列的抽象和简化 最终都可以通过简化的数学模型进行描述 生物发酵过程的可模型化使得生物发酵过程的通用仿真软件的开发成为可能 作者通过以重组毕氏酵母发酵过程为研究对象 深入了解了一般生物发酵过程的过程建模 模型仿真 模型优化和优化控制等几个方面的实际问题 软件采用了LabVIEW 6.i 版本的开发环境 给出了一般生物发酵过程模型的通用仿真软件的实现流程 第一步 生物发酵过程的数学模型建立以后 就需要人工地把数学模型进行标准化 为生物过程数学模型的输入做准备 第二步 在数学模型标准化以后 就需要把标准数学模型通过模型输入模块输入到程序中 并把主要参数以全局变量的形式进行存储 并输出一个标准数学模型的参数和变量表 第三步 在生物发酵过程的结构模型辨识完成后 就可以进行过程模型的参数辨识 即在确定某个目标函数后 通过某种最优化算法 对一些对目标变量的具有关键影响的参数进行优化 从而使得通过理论建立的过程数学模型更加符合实际的.