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摘要 I
论文题目大肠杆菌内源过氧化氢检测方法的建立 学院及专业食品与生物工程学院 食科 本科生 指导教师 摘 要 本实验旨在通过物理、化学方法的对比及探索改进找出一种检测细菌内源过氧化氢的模型方法。
本实验以大肠杆菌突变体为研究对象首先以30的H2O2为研究对象确定其原液的浓度然后通过辣根过氧化物酶—酚红法、荧光法、硫酸钛法三种不同方法绘制出不同的标准曲线最后根据不同的标准曲线计算出20个大肠杆菌抗氧化基因突变体菌株在同一生长时期时内源过氧化氢的释放量。
结果显示30的H2O2原液浓度为6.9M三种检测方法绘制出来的标准曲线的线性相关系数分别是0.9963、0.9936、0.997根据辣根过氧化物酶—酚红法和荧光法不同的线性关系计算出来不同菌株H2O2的释放量都有明显的差异范围在1μM10μM之间。
硫酸钛法的检测区间在10μM500μM之间明显检测不到大肠杆菌抗氧化基因突变体菌株中内源过氧化氢的释放量。
通过分析对比发现三种方法中辣根过氧化物酶—酚红法和荧光法都可以检测到大肠杆菌抗氧化基因突变体菌株中内源过氧化氢的释放量硫酸钛法检测不到但是辣根过氧化物酶—酚红法比较繁琐且需要严格控制反应条件而荧光法的灵敏度比较高操作也比较简单方便。
关 键 词内源过氧化氢检测方法大肠杆菌突变体 摘要 II Subject: Measure assays establishment of endogenous hydrogen peroxide in Escherichia coli College and Specialty: College of Food amp Bioengineering Food Science amp Engineering Name: Supervisor: ABSTRACT This experiment is for the purpose of discovering one detection model method to detect endogenous hydrogen peroxide by physical chemistry method contrast and the exploration improvement. This experiment takes the Escherichia coli mutants as the objects of study first take 30 H2O2 as the object of study and determine the density of its original fluid then through the horse radish peroxide enzyme - phenol red method the fluorescence method the titanium sulfate method three different methods draws up the different standard curve Finally according to different standard curve to figure out endogenous hydrogen peroxide release quantity of the twenty Escherichia coli oxidation resistance gene mutant strains in the identical growth period. The results showed that 30 H2O2 original fluid density is 6.9M use three detection methods to draw up the standard curves and whose linear correlation coefficient respectively are 0.9963 0.9936 0.997 calculates that the H2O2 release quantity of different strains have the obvious difference according to different linear relationship of the horse radish peroxide enzyme - phenol red method and the fluorescence method the scope is between 1μM10μM. The detection interval of Titanium sulfate method is between 10μM500μM so obviously we cannot examine the endogenous hydrogen peroxide release quantity in Escherichia coli oxidation resistance gene mutant strain. Through the analysis contrast we discover that the horse radish peroxide enzyme - 摘要 III phenol red method and the fluorescence method may examine the endogenous hydrogen peroxide release quantity in the escherichia coli oxidation resistance gene mutant strain in this three methods the titanium sulfate method can not examine that but the horse radish peroxide enzyme - phenol red method is quite trival and needs the strict control condition while the fluorescence method has quite high sensitivityand the operation is also quite simple and convenient. Keywordsendogenous hydrogen peroxide detection method escherichia coli mutant strain 目 录 第1章 文献综述 .......................................... 5 目录 IV 1.1 过氧化氢 ......................................... 5 1.2过氧化氢的应用 .................................... 2 1.3过氧化氢的测定方法 ................................ 3 1.4过氧化氢检测方法的发展趋势 ........................ 5 1.5过氧化氢测定方法优缺点分析 ........................ 5 1.6大肠杆菌的特点 .................................... 6 1.7 在生物技术中的应用 ............................... 8 第2章 硫酸钛法测大肠杆菌内源过氧化氢 .................... 10 2.1材料和方法 ....................................... 10 2.1.1 试剂............................................................................... 10 2.1.2 仪器............................................................................... 10 2.1.3实验方法 ........................................................................ 10 2.2 实验结果 ........................................ 10 2.3 结果分析与讨论 .................................. 13 第3章 辣根过氧化物酶酚红法测大肠杆菌内源过氧化氢 ........ 14 3.1材料和方法 ....................................... 14 3.1.1试剂................................................................................ 14 3.1.2 仪器............................................................................... 14 3.1.3溶液的配制 .................................................................... 14 3.1.4实验方法 ........................................................................ 14 3.2实验结果 ......................................... 15 目录 V 3.3结果分析与讨论 ................................... 20 第4章 荧光法测定大肠杆菌内源过氧化氢 ................... 21 4.1材料和方法 ....................................... 21 4.1.1 试剂............................................................................... 21 4.1.2 仪器............................................................................... 21 4.1.3 溶液配制 ....................................................................... 21 4.1.4 实验方法 ....................................................................... 21 4.2 实验结果 ........................................ 22 4.3结果分析与讨论 ................................... 25 第5章 结论 ............................................. 26 参考文献 ................................................ 27 致谢 .................................................... 29 第1章 文献综述 1.1 过氧化氢 过氧化氢是1818年由法国化学家JHThenard发现又名双氧水分子式第1章 文献综述 2 为H202为无色、无气味的液体具有苦涩味易分解为水和氧气。
过氧化氢是一种强氧化剂它作为一种重要的化工产品具有消毒、杀菌、漂白等功能在纺织品、纸浆漂白、化学产品的合成以及环保领域和医疗领域中广泛应用。
过氧化氢在自然界中也广泛存在。
近年来天然水地表水、大气水滴及降水等中的活性物质单重态氧、羟基自由基、过氧化物、超氧化物等引起了人们极大的注意。
这些活性物质与天然水中发生的氧化还原反应有密切关系是影响化学品在水环境中的迁移、转化、归宿及生态效应的重要因素。
过氧化氢是一种重要的痕量气体并且在对流层中扮演了一个很重要的角色。
过氧化氢还间接的影响了酸雨的形成它对大气的质量是非常有害的。
吸入过量过氧化氢可使人中毒空气中过氧化氢含量不得超过1.4 mgm3。
过氧化氢在生物体中极为重要。
过氧化氢在植物体中广泛存在植物细胞可以通过多条途径产生H202H202已经被认为是植物中的一种信号分子因为过氧化氢是许多酶催化反应的产物通过测定过氧化氢可以间接测定许多底物或酶的含量。
过氧化氢是生物体内主要的活性氧之一它虽不是自由基但分子中含有较易断裂的过氧键常被诱发均裂产生羟自由基OH??它是最活泼的活性氧又称之为侵袭性自由基1。
过氧化氢是生物体内的一种代谢产物超量过氧化氢能够对生物系统产生有害作用它还与中神经病理学中的枢神经系统疾病有关。
可见过氧化氢在环境中广泛存在过氧化氢的测定在食品检验、药物分析和环境监测等方面都有很重要的意义。
迄今国内外学者对天然水中过氧化氢的含量、分布、生成机理及光化学反应等方面进行了大量的研究。
如何测定过氧化氢也一直以来是科研工作者研究的热点。
1.2过氧化氢的应用 过氧化氢目前广泛应用于纺织印染、化工、造纸、环境保护和电子工业等领域近年来其在环境领域和食品安全领域的作用显得尤其突出。
1.2.1 环境领域 目前水资源的有效利用为环境工作者研究的重点。
工业上高浓度难降解有毒有害有机废水的有效处理为国内外环境工作者和安全工作者的难题而能产生强氧化性的羟基自由基可以很方便地采用亚铁和过氧化氢组成的芬顿试剂产生。
因此过氧化氢能处理多种无机和有机的有毒物质可以治理各种高浓度难降解的工业废水治理效果十分明显。
过氧化氢氧化和芬顿试剂由于其无二次污染备受环境工作者和安全工作者的厚爱。
国外发达国家已经将过氧化氢用于环境保护应用规模呈增长趋势而我国由于成本问题在这方面的应用较少。
但是其有第1章 文献综述 3 效应用与突出效果还是备受环境工作者和安全工作者的推崇。
1.2.2 食品行业 过氧化氢在食品包装、食品纤维等方面用作消毒杀菌剂2产生大量活泼的羟基自由基具有极强的氧化性可将很多有机污染物最终氧化分解为水和二氧化碳。
过氧化氢在食品行业具有较为广泛的应用但是其残留问题是安全工作者要首先考虑的问题。
为有效降低安全风险体现“科技以人为本”的现代化理念必须对过氧化氢的浓度进行有效监测。
1.2.3 纺织行业 纺织工业是我国过氧化氢的最大用户主要用于各种纺织物和针织物的漂白3。
近几年虽因纺织工业结构调整和市场疲软对过氧化氢需求量的增长缓慢。
但随纺织企业生产技术的不断提高和纯棉织品受到人们青睐预计今后几年国内纺织行业对过氧化氢的需求还会增加。
1.2.4 其他行业 过氧化氢在化工行业上的应用是相当广泛的。
它是合成许多无机、有机过氧化物的主要原料4。
近几年国内重视精细化工产品的生产积极开发包括过氧化氢下游产品在内的新产品使过氧化氢在化工行业上的消费呈上升趋势。
此外过氧化氢还广泛应用于造纸业、电子行业等在冶金行业的电镀液净化除铁、毛皮、烟草漂白火箭、鱼雷等军工用的化学推进剂、化妆品行业5等也都有一定应用。
因此过氧化氢可以说是与人们生活、安全健康、环境污染、社会进步等休戚相关其准确检测的有效性和必要性日益提上日程。
1.3 过氧化氢的测定方法 1.3.1 常规滴定法 最早用于过氧化氢测定的常规滴定法是根据过氧化氢具有的很强的氧化还原性而形成的一种最普遍的常规分析法。
如KMm04法该法是在室温下的稀H2S04介质中以MnS04为催化剂用KdVm04标准溶液直接滴定H202该方法利用KMn04自身指示剂来确定滴定的终点再根据滴定耗用的标准液的体积求出H202含量。
滴定法操作简单不需要昂贵的仪器但是此方法测定过程比较费时终点颜色变化不明显干扰因素较多许多具有氧化还原活性的物质都有可能对测定结果产生干扰。
并且此方法的准确度和灵敏度不高达不到许多微量、痕量测定的要求不能连第1章 文献综述 4 续化、微量化。
1.3.2 分光光度法 分光光度法可以分为三类①碘离子的氧化②金属离子的氧化③有机物的显色反应6。
分光光度法的灵敏度取决于产生吸光物质的摩尔吸收系数选择能产生高摩尔吸收系数的物质能够使其灵敏度大大提高。
分光光度法的灵敏度、准确度要优于传统的滴定法但是任何一种分光光度法都需要加入一种显色剂并使H202在合适的条件下与之发生发应从而确定的H202的含量。
因此方法较为复杂而且其它过氧化物往往会对其测定产生干扰使这种方法不适用于许多复杂的测量体系。
1.3.3 电化学方法 电化学方法7-10主要包括极谱法、电流法以及恒电位法。
近年来许多科学工作者利用各种修饰电极对过氧化氢进行了测定。
电化学方法具有很高的灵敏度但是它一般要利用酶或者模拟酶等试剂作为反应试剂这使它的稳定性降低并且大大增加了检测的成本。
很多修饰电极的制作方法也较为复杂这使电化学方法具有了一定的局限性。
1.3.4 荧光法 荧光法的一般原理是在过氧化酶作用下基质与H202反应产生荧光物质根据荧光强度与H202成正比的关系确定H202浓度。
荧光法1112的灵敏度高由于一般采用酶作为反应试剂使该方法具有比较好的选择性但是生物酶价格较高且不易长期保存在使用过程中的失活或活性降低将会给实际分析带来诸多不便。
虽然已经可以在某些情况下用过氧化物模拟酶代替生物酶但是也存在过氧化物干扰等缺点。
1.3.5 其它方法 除了上述几种方法外较常用的还有室温磷光分析法1314、化学发光法14-16、电致化学发光法17、色谱法1819等几种方法。
其中室温磷光分析较其它方法有它自己独特的优越性1灵敏度高2大大降低成本和简化操作步骤3分析曲线线性范围宽 4选择性好 5检测限低 6可实现连续操作易于实现自动化。
化学发光法具有较高的灵敏度、可控的发射速率以及较宽的动力学范围但是这种方法同样需要与之反应的一个发光试剂或是催化剂等使其产生发光信号。
电致化第1章 文献综述 5 学发光法也有其独特的特点1分析的选择性高 2具有极高的灵敏度及很宽的动力学响应范围3反应迅速4扩大了化学发光法可检测物质的范围5易于与其他技术联用。
色谱法也能用于过氧化氢的分析测定。
该方法具有准确度高易操作实用性强等优点。
色谱法能够对不同的过氧化物进行分离和定量与其它方法相比具有一定的优越性。
但是色谱法对仪器的要求比较高所需要的仪器昂贵对流动相的纯度要求高。
目前这种方法用于过氧化氢的分析还有待进一步研究和改进。
1.4 过氧化氢检测方法的发展趋势 目前对过氧化氢的检测主要就是以上的几种方法每种方法都有其有缺点。
电化学分析法具有很好的灵敏度但是对于干扰的消除和提高方法的稳定性和重现性仍然是今后研究的重点20分光光度法的所需的设备比较简单但是要提高其灵敏度就还需要寻找具有高摩尔吸收系数的物质特别是有机显色剂荧光光度法和化学发光法灵敏度高可以很容易的结合流动注射技术使其实现连续操作和实时监测提高检测速度还可以利用酶提高其方法的选择性21但是利用酶反应同时也带来了一些问题比如说酶试剂价格昂贵不利于长期保存等发现新的高效的发光试剂和荧光试剂用于过氧化氢的测量仍然是科学工作者的研究重点之一。
由于具有较高的灵敏度和容易实现在线分析等优点电化学方法和化学发光法的应用比较广泛。
此外还有待发现新的、灵敏度高、选择性好的测定过氧化氢的方法。
1.5过氧化氢测定方法优缺点分析 测定方法 优点 缺点 第1章 文献综述 6 常规滴定法 电化学分析方法 分光光度法 化学发光法 荧光光度法 色谱法 方法简单 方法简单 干扰因素多 方法简单选择性较好 灵敏度高pH选择范围宽 灵敏度高 需要昂贵的设备 灵敏度高可实现连续自动操作 干扰因素多 装置较复杂 灵敏度干扰因素多 需要昂贵的设备 操作复杂干扰因素多 需要昂贵的设备操作复杂 目前国内外对于液相过氧化氢的测定技术总体来说已相对成熟然而随着科学的不断进步社会需求和发展科研人员的不断尝试、探索和努力新的测试方法也将相继面世。
因此要结合实验条件根据所需的测试要求和实际可操作条件选择合适的测试方法至关重要。
分光光度法由于方法简单不需要复杂的设备选择性较好应用非常广泛在实验技术条件普遍不高的条件下通过对常规方法的改进提高其灵敏度和效率是一种简单又有效的方法。
本实验以大肠杆菌为研究对象通过对其内源过氧化氢含量的检测找出检测内源过氧化氢的简单有效的模型方法22。
1.6大肠杆菌的特点 大肠杆菌Escherichia coliE.coli 革兰氏阴性短杆菌大小0.5×13微米。
周身鞭毛能运动无芽孢。
能发酵多种糖类产酸、产气是人和动物肠道中的正常栖居菌婴儿出生后即随哺乳进入肠道与人终身相伴其代谢活动能抑制肠道内分解蛋白质的微生物生长减少蛋白分解产物对人体的危害还能合成维生素B和K以及有杀菌作用的大肠杆菌素。
正常栖居条件下不致病。
但若进入胆囊、膀胱等处可引起炎症23。
在肠道中大量繁殖几占粪便干重的1/3。
兼性厌氧菌。
在环境卫生不良的情况下常随粪便散布在周围环境中。
若在水和食品中检出此菌可认为是被粪便污染的指标从而可能有肠道病原菌的存在。
因此大肠菌群数或大肠菌值常作为饮水和食物或药物的卫生学标准。
除某些菌型能引起腹泻外一般不致病能合成维生素B和K对人体有益。
大肠杆菌是现代生物学中研究最多的一种细菌作为一种模式生物其基因组序列已全部测出遗传背景清楚培养条件简单表达高效用分子生物学方法在大肠杆菌得出的结论可用于其它生物的研究。
此外在生物工程中大肠杆菌被广泛用于基因复制和表达经常作为细菌的模式生物广泛用于科学研究。
大肠杆菌的一个株是具有某些能和其它柱区分开第1章 文献综述 7 的特征的族群。
不同的大肠杆菌菌株生活在不同动物中因此我们可以通过其判断粪便来源于人或者鸟类等。
通过突变新的大肠杆菌菌株不断出现其中一些可能对宿主动物造成损害。
尽管对于大多数健康成年人这样的菌株可能只引起一场腹泻或者根本没有症状但对于幼儿、大病初愈的人或者进行某些药物治疗的人来说陌生的菌株可能引起严重疾病甚至死亡24。
大肠杆菌O157:H7就是一个毒性很强的菌株。
大肠杆菌是人和许多动物肠道中最主要且数量最多的一种细菌周身鞭毛能运动无芽孢。
主要生活在大肠内。
大肠杆菌—纳米级图像 大肠杆菌平板培养基 1大肠杆菌是细菌属于原核生物具有由肽聚糖组成的细胞壁只含有核糖体简单的细胞器没有细胞核有拟核细胞质中的质粒常用作基因工程中的运载体。
2大肠杆菌的代谢类型是异养兼性厌氧型。
3人体与大肠杆菌的关系在不致病的情况下正常状况下可认为是互利共生一般高中阶段认为是这种关系在致病的情况下可认为是寄生。
4培养基中加入伊红美蓝遇大肠杆菌菌落呈深紫色并有金属光泽可鉴别大肠杆菌是否存在。
5大肠杆菌在生物技术中的应用 大肠杆菌作为外源基因表达的宿主遗传背景清楚技术操作简单培养条件简单大规模发酵经济倍受遗传工程专家的重视。
目前大肠杆菌是应用最广泛最成功的表达体系常做高效表达的首选体系。
6大肠杆菌在生态系统中的地位假如它生活在大肠内属于消费者假如生活在体外则属于分解者。
1.6.1 致病性 当前大肠杆菌病带来的损失越来越大其难于治愈、死亡率高、极易复发等临床特点临床通常多考虑的是抗菌素耐药、继发或并发感染、药物靶部位等因素其实还忽视了一个引起包心包肝、气囊炎、败血症、肠炎及发热等常见临床第1章 文献综述 8 病症的另一个重要元凶——大肠杆菌死亡溶解释放的内毒素。
1.6.2致病物质 大肠杆菌具有很多毒力因子包括内毒素荚膜〣型分泌系统黏附素和外毒素等。
黏附素能使细菌紧密黏着在泌尿道和肠道的细胞上避免因排尿时尿液的冲刷和肠道的蠕动作用而被排除。
外毒素:大肠杆菌能产多种的外毒素包括志贺毒素〡和〢耐热肠毒.