【原创论文全套栏目提醒】:网学会员原创论文全套为您提供食品科学和生物技术专业原创毕业论文word格式 - 毕业设计参考,解决您在食品科学和生物技术专业原创毕业论文word格式 - 毕业设计学习中工作中的难题,参考学习。
论文题目:大肠杆菌内源过氧化氢检测方法的建立 学院及专业:食品与生物工程学院 食科 本科生: 指导教师: 摘 要 本实验旨在通过物理、化学方法的对比及探索改进,找出一种检测细菌内源过氧化氢的模型方法。
本实验以大肠杆菌突变体为研究对象,首先以 30的 H2O2 为研究对象,确定其原液的浓度,然后通过辣根过氧化物酶—酚红法、荧光法、硫酸钛法三种不同方法绘制出不同的标准曲线,最后根据不同的标准曲线计算出 20 个大肠杆菌抗氧化基因突变体菌株在同一生长时期时内源过氧化氢的释放量。
结果显示:30的 H2O2 原液浓度为 6.9M,三种检测方法绘制出来的标准曲线的线性相关系数分别是 0.9963、0.9936、0.997,根据辣根过氧化物酶—酚红法和荧光法不同的线性关系计算出来不同菌株 H2O2 的释放量都有明显的差异,范围在 1μM~10μM 之间。
硫酸钛法的检测区间在 10μM~500μM 之间,明显检测不到大肠杆菌抗氧化基因突变体菌株中内源过氧化氢的释放量。
通过分析对比发现三种方法中辣根过氧化物酶—酚红法和荧光法都可以检测到大肠杆菌抗氧化基因突变体菌株中内源过氧化氢的释放量,硫酸钛法检测不到,但是辣根过氧化物酶—酚红法比较繁琐且需要严格控制反应条件,而荧光法的灵敏度比较高,操作也比较简单方便。
关 键 词:内源过氧化氢,检测方法,大肠杆菌,突变体Subject: Measure assays establishment of endogenous hydrogen peroxide in Escherichia coliCollege and Specialty: College of Food amp Bioengineering Food Science amp EngineeringName:Supervisor: ABSTRACT This experiment is for the purpose of discovering one detection model method todetect endogenous hydrogen peroxide by physical che
mistry method contrast and theexploration improvement. This experiment takes the Escherichia coli mutants as the objects of study first take30 H2O2 as the object of study and determine the density of its original fluid thenthrough the horse radish peroxide enzyme - phenol red method the fluorescence methodthe titanium sulfate method three different methods draws up the different standardcurve Finally according to different standard curve to figure out endogenous hydrogenperoxide release quantity of the twenty Escherichia coli oxidation resistance genemutant strains in the identical growth period. The results showed that 30 H2O2 original fluid density is 6.9M use three detectionmethods to draw up the standard curves and whose linear correlation coefficientrespectively are 0.9963 0.9936 0.997 calculates that the H2O2 release quantity ofdifferent strains have the obvious difference according to different linear relationship ofthe horse radish peroxide enzyme - phenol red method and the fluorescence method thescope is between 1μM10μM. The detection interval of Titanium sulfate method isbetween 10μM500μM so obviously we cannot examine the endogenous hydrogenperoxide release quantity in Escherichia coli oxidation resistance gene mutant strain. Through the analysis contrast we discover that the horse radish peroxide enzyme -phenol red method and the fluorescence method may examine the endogenous hydrogenperoxide release quantity in the escherichia coli oxidation resistance gene mutant strainin this three methods the titanium sulfate method can not examine that but the horseradish peroxide enzyme - phenol red method is quite trival and needs the strict controlcondition while the fluorescence method has quite high sensitivityand the operation isalso quite simple and convenient.Keywords:endogenous hydrogen peroxide detection method escherichia coli mutant strain 目 录第 1 章 文献综述............................................5 1.1 过氧化氢 ......................................... 5 目录 1.2 过氧化氢的应用 ................................... 2 1.3 过氧化氢的测定方法 ............................... 3 1.4 过氧化氢检测方法的发展趋势 ....................... 5 1.5 过氧化氢测定方法优缺点分析 ....................... 5 1.6 大肠杆菌的特点 ................................... 6 1.7 在生物技术中的应用 ............................... 8第 2 章 硫酸钛法测大肠杆菌内源过氧化氢 .....................10 2.1 材料和方法 ...................................... 10 2.1.1 试剂.................................................................................. 10 2.1.2 仪器.................................................................................. 10 2.1.3 实验方法 .......................................................................... 10 2.2 实验结果........................................ 10 2.3 结果分析与讨论 .................................. 13第 3 章 辣根过氧化物酶酚红法测大肠杆菌内源过氧化氢 .........14 3.1 材料和方法 ...................................... 14 3.1.1 试剂................................................................................... 14 3.1.2 仪器.................................................................................. 14 3.1.3 溶液的配制 ...................................................................... 14 3.1.4 实验方法 .......................................................................... 14 3.2 实验结果 ........................................ 15 3.3 结果分析与讨论 .................................. 20 IV 目录第4章 荧光法测定大肠杆菌内源过氧化氢 ....................21 4.1 材料和方法 ...................................... 21 4.1.1 试剂.................................................................................. 21 4.1.2 仪器.................................................................................. 21 4.1.3 溶液配制 ......................................................................... 21 4.1.4 实验方法 ......................................................................... 21 4.2 实验结果........................................ 22 4.3 结果分析与讨论 .................................. 25第 5 章 结论...............................................26参考文献..................................................27致谢......................................................29 第 1 章 文献综述 1.1 过氧化氢 过氧化氢是 1818 年由法国化学家 J.H.Thenard 发现,又名双氧水,分子式 为 H202,为无色、无气味的液体,具有苦涩味,易分解为水和氧气。
过氧化氢是 一种强氧化剂,它作为一种重要的化工产品具有消毒、杀菌、漂白等功能,在纺 V 第 1 章 文献综述织品、纸浆漂白、化学产品的合成以及环保领域和医疗领域中广泛应用。
过氧化氢在自然界中也广泛存在。
近年来,天然水地表水、大气水滴及降水等中的活性物质单重态氧、羟基自由基、过氧化物、超氧化物等引起了人们极大的注意。
这些活性物质与天然水中发生的氧化还原反应有密切关系,是影响化学品在水环境中的迁移、转化、归宿及生态效应的重要因素。
过氧化氢是一种重要的痕量气体并且在对流层中扮演了一个很重要的角色。
过氧化氢还间接的影响了酸雨的形成,它对大气的质量是非常有害的。
吸入过量过氧化氢可使人中毒,空气中过氧化氢含量不得超过 1.4 mg/m3。
过氧化氢在生物体中极为重要。
过氧化氢在植物体中广泛存在,植物细胞可以通过多条途径产生 H202,H202 已经被认为是植物中的一种信号分子,因为过氧化氢是许多酶催化反应的产物,通过测定过氧化氢,可以间接测定许多底物或酶的含量。
过氧化氢是生物体内主要的活性氧之一,它虽不是自由基,但分子中含有较易断裂的过氧键,常被诱发均裂,产生羟自由基OH,它是最活泼的活性氧,又称之为侵袭性自由基1。
过氧化氢是生物体内的一种代谢产物,超量过氧化氢能够对生物系统产生有害作用,它还与中神经病
理学中的枢神经
系统疾病有关。
可见,过氧化氢在环境中广泛存在,过氧化氢的测定在食品检验、药物分析和环境监测等方面都有很重要的意义。
迄今,国内外学者对天然水中过氧化氢的含量、分布、生成机理及光化学反应等方面进行了大量的研究。
如何测定过氧化氢也一直以来是科研工作者研究的热点。
1.2 过氧化氢的应用 过氧化氢目前广泛应用于纺织印染、化工、造纸、环境保护和电子工业等领域,近年来,其在环境领域和食品安全领域的作用显得尤其突出。
1.2.1 环境领域 目前,水资源的有效利用为环境工作者研究的重点。
工业上高浓度难降解有毒有害有机废水的有效处理为国内外环境工作者和安全工作者的难题,而能产生强氧化性的羟基自由基,可以很方便地采用亚铁和过氧化氢组成的芬顿试剂产生。
因此,过氧化氢能处理多种无机和有机的有毒物质,可以治理各种高浓度难降解的工业废水,治理效果十分明显。
过氧化氢氧化和芬顿试剂由于其无二次污染,备受环境工作者和安全
工作者的厚爱。
国外发达国家已经将过氧化氢用于环境保护,应用规模呈增长趋势,而我国由于成本问题在这方面的应用较少。
但是其有效应用与突出效果还是备受环境工作者和安全工作者的推崇。
2 第 1 章 文献综述1.2.2 食品行业 过氧化氢在食品包装、食品纤维等方面用作消毒杀菌剂2,产生大量活泼的羟基自由基,具有极强的氧化性,可将很多有机污染物最终氧化分解为水和二氧化碳。
过氧化氢在食品行业具有较为广泛的应用,但是,其残留问题是安全工作者要首先考虑的
问题。
为有效降低安全风险,体现“科技以人为本”的现代化理念,必须对过氧化氢的浓度进行有效监测。
1.2.3 纺织行业 纺织工业是我国过氧化氢的最大用户,主要用于各种纺织物和针织物的漂白3 。
近几年虽因纺织工业结构调整和市场疲软,对过氧化氢需求量的增长缓慢。
但随纺织企业生产技术的不断提高和纯棉织品受到人们青睐,预计今后几年国内纺织行业对过氧化氢的需求还会增加。
1.2.4 其他行业 过氧化氢在化工行业上的应用是相当广泛的。
它是合成许多无机、有机过氧化物的主要原料4。
近几年国内重视精细化工产品的生产,积极开发包括过氧化氢下游产品在内的新产品,使过氧化氢在化工行业上的消费呈上升趋势。
此外,过氧化氢还广泛应用于造纸业、电子行业等;在冶金行业的电镀液净化除铁、毛皮、烟草漂白,火箭、鱼雷等军工用的化学推进剂、化妆品行业5等也都有一定应用。
因此,过氧化氢可以说是与人们生活、安全健康、环境污染、社会进步等休戚相关,其准确检测的有效性和必要性日益提上日程。
1.3 过氧化氢的测定方法1.3.1 常规滴定法 最早用于过氧化氢测定的常规滴定法是根据过氧化氢具有的很强的氧化还原性而形成的一种最普遍的常规分析法。
如KMm04法,该法是在室温下的稀H2S04介质中,以MnS04为催化剂,用KdVm04标准溶液直接滴定H202:该方法利用KMn04自身指示剂来确定滴定的终点,再根据滴定耗用的标准液的体积求出H202含量。
滴定法操作简单,不需要昂贵的仪器,但是此方法测定过程比较费时,终点颜色变化不明显,干扰因素较多,许多具有氧化还原活性的物质都有可能对测定结果产生干扰。
并且此方法的准确度和灵敏度不高,达不到许多微量、痕量测定的要求,不能连续化、微量化。
3 第 1 章 文献综述1.3.2 分光光度法 分光光度法可以分为三类:①碘离子的氧化;②金属离子的氧化;③有机物的显色反应6。
分光光度法的灵敏度取决于产生吸光物质的摩尔吸收系数,选择能产生高摩尔吸收系数的物质能够使其灵敏度大大提高。
分光光度法的灵敏度、准确度要优于传统的滴定法,但是任何一种分光光度法都需要加入一种显色剂,并使H202在合适的条件下与之发生发应,从而确定的H202的含量。
因此方法较为复杂,而且其它过氧化物往往会对其测定产生干扰,使这种方法不适用于许多复杂的测量体系。
1.3.3 电化学方法 电化学方法7-10主要包括极谱法、电流法以及恒电位法。
近年来,许多科学工作者利用各种修饰电极对过氧化氢进行了测定。
电化学方法具有很高的灵敏度,但是它一般要利用酶或者模拟酶等试剂作为反应试剂,这使它的稳定性降低,并且大大增加了检测的成本。
很多修饰电极的制作方法也较为复杂,这使电化学方法具有了一定的局限性。
1.3.4 荧光法 荧光法的一般原理是在过氧化酶作用下,基质与H202反应产生荧光物质,根据荧光强度与H202成正比的关系确定H202浓度。
荧光法1112的灵敏度高,由于一般采用酶作为反应试剂使该方法具有比较好的选择性,但是生物酶价格较高,且不易长期保存,在使用过程中的失活或活性降低将会给实际分析带来诸多不便。
虽然已经可以在某些情况下用过氧化物模拟酶代替生物酶,但是也存在过氧化物干扰等缺点。
1.3.5 其它方法 除了上述几种方法外,较常用的还有室温磷光分析法1314、化学发光法14-16、电致化学发光法17、色谱法1819等几种方法。
其中室温磷光分析较其它方法有它自己独特的优越性:1灵敏度高2大大降低成本和简化操作步骤3分析曲线线性范围宽 4选择性好 5检测限低 6可实现连续操作,易于实现自动化。
化学发光法具有较高的灵敏度、可控的发射速率以及较宽的动力学范围,但是这种方法同样需要与之反应的一个发光试剂或是催化剂等使其产生发光信号。
电致化学发光法也有其独特的特点:1分析的选择性高 2具有极高的灵敏度及很宽的动力学响应范围;3反应迅速4扩大了化学发光法可检测物质的范围;5易于 4 第 1 章 文献综述与其他技术联用。
色谱法也能用于过氧化氢的分析测定。
该方法具有准确度高,易操作,实用性强等优点。
色谱法能够对不同的过氧化物进行分离和定量,与其它方法相比具有一定的优越性。
但是色谱法对仪器的要求比较高,所需要的仪器昂贵,对流动相的纯度要求高。
目前,这种方法用于过氧化氢的分析还有待进一步研究和改进。
1.4 过氧化氢检测方法的发展趋势 目前,对过氧化氢的检测主要就是以上的几种方法,每种方法都有其有缺点。
电化学分析法具有很好的灵敏度,但是对于干扰的消除和提高方法的稳定性和重现性仍然是今后研究的重点20;分光光度法的所需的设备比较简单,但是要提高其灵敏度就还需要寻找具有高摩尔吸收系数的物质,特别是有机显色剂;荧光光度法和化学发光法灵敏度高,可以很容易的结合流动注射技术使其实现连续操作和实时监测,提高检测速度,还可以利用酶提高其方法的选择性21,但是利用酶反应同时也带来了一些问题,比如说酶试剂价格昂贵,不利于长期保存等,发现新的高效的发光试剂和荧光试剂用于过氧化氢的测量仍然是科学工作者的研究重点之一。
由于具有较高的灵敏度和容易实现在线分析等优点,电化学方法和化学发光法的应用比较广泛。
此外,还有待发现新的、灵敏度高、选择性好的测定过氧化氢的方法。
1.5 过氧化氢测定方法优缺点分析 测定方法 优点 缺点 5 第 1 章 文献综述 常规滴定法 方法简单 干扰因素多 电化学分析方法 方法简单 干扰因素多 装置较复杂 分光光度法 方法简单,选择性较好 灵敏度干扰因素多 化学发光法 灵敏度高,pH 选择范围宽 需要昂贵的设备 荧光光度法 灵敏度高 需要昂贵的设备 操作复杂,干扰因素多 色谱法 灵敏度高,可实现连续自动操作 需要昂贵的设备,操作复 杂 目前,国内外对于液相过氧化氢的测定技术总体来说已相对成熟,然而,随着科学的不断进步,社会需求和发展,科研人员的不断尝试、探索和努力,新的测试方法也将相继面世。
因此,要结合实验条件,根据所需的测试要求和实际可操作条件,选择合适的测试方法至关重要。
分光光度法由于方法简单,不需要复杂的设备,选择性较好,应用非常广泛;在实验技术条件普遍不高的条件下,通过对常规方法的改进,提高其灵敏度和效率,是一种简单又有效的方法。
本实验以大肠杆菌为研究对象,通过对其内源过氧化氢含量的检测,找出检测内源过氧化氢的简单有效的模型方法22。
1.6 大肠杆菌的特点 大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli) 革兰氏阴性短杆菌,大小 0.5×1~3 微米。
周身鞭毛,能运动,无芽孢。
能发酵多种糖类产酸、产气,是人和动物肠道中的正常栖居菌,婴儿出生后即随哺乳进入肠道,与人终身相伴,其代谢活动能抑制肠道内分解蛋白质的微生物生长,减少蛋白分解产物对人体的危害,还能合成维生素 B 和 K,以及有杀菌作用的大肠杆菌素。
正常栖居条件下不致病。
但若进入胆囊、膀胱等处可引起炎症 23 。
在肠道中大量繁殖,几占粪便干重的 1/3。
兼性厌氧菌。
在环境卫生不良的情况下,常随粪便散布在周围环境中。
若在水和食品中检出此菌,可认为是被粪便污染的指标,从而可能有肠道病原菌的存在。
因此,大肠菌群数(或大肠菌值)常作为饮水和食物(或药物)的卫生学标准。
除某些菌型能引起腹泻外,一般不致病,能合成维生素 B 和 K,对人体有益。
大肠杆菌是现代生物学中研究最多的一种细菌,作为一种模式生物,其基因组序列已全部测出,遗传背景清楚培养条件简单表达高效,用分子生物学方法在大肠杆菌得出的结论可用于其它生物的研究。
此外,在生物工程中,大肠杆菌被广泛用于基因复制和表达,经常作为细菌的模式生物广泛用于科学研究。
大肠杆菌的一个株是具有某些能和其它柱区分开 6 第 1 章 文献综述的特征的族群。
不同的大肠杆菌菌株生活在不同动物中,因此我们可以通过其判断粪便来源于人或者鸟类等。
通过突变,新的大肠杆菌菌株不断出现,其中一些可能对宿主动物造成损害。
尽管对于大多数健康成年人,这样的菌株可能只引起一场腹泻,或者根本没有症状,但对于幼儿、大病初愈的人或者进行某些药物治疗的人来说,陌生的菌株可能引起严重疾病甚至死亡24。
大肠杆菌 O157:H7 就是一个毒性很强的菌株。
大肠杆菌是人和许多动物肠道中最主要且数量最多的一种细菌,周身鞭毛,能运动,无芽孢。
主要生活在大肠内。
大肠杆菌—纳米级图像 大肠杆菌平板培养基 1大肠杆菌是细菌,属于原核生物;具有由肽聚糖组成的细胞壁,只含有核糖体简单的细胞器,没有细胞核有拟核;细胞质中的质粒
常用作基因工程中的运载体。
2大肠杆菌的代谢类型是异养兼性厌氧型。
3人体与大肠杆菌的关系:在不致病的情况下(正常状况下),可认为是互利共生(一般高中阶段认为是这种关系);在致病的情况下,可认为是寄生。
4培养基中.