)表达cDNA或 实验确认的技术路线流程 氨基酸序列)。
Fig.1 Strategy of in silieo identification and experimental verification of novel human gene .120. 生命科学研究Life Science Resea rch1.2实验克隆 研究中心承担的国家“863”计划人类新基因功能体 通过逆转录聚合酶链式反应(RT—PCR)克隆人 内、外筛选平台上初步鉴定功能,发现有价值的人类新基因cDNA序列并测序,得到重组质粒后通过 类新基因,并及时重点研究功能结构域独特的几个基因表达谱分析等实验技术验证其客观存在性。
人类新基因的重要功能。
1.2.1质粒和菌株 质粒pGEM-T-easy载体购自Promega公司; 2 结果E.coil XLl-blue由王琰教授馈赠。
1.2.2工具酶及试剂 识别到100个人类小分子肽类编码新基因,具 限制性内切酶,DNA修饰酶,T4 DNA连接 有典型基因特点和一定功能结构域,其中23个基酶,Taq DNA聚合酶购于Boehringer Mannheim, 因被GenBank接受并被国际人类基因组组织(HU—GIBCO-BRL,Promega,TaKaRa等公司。
DNA标 GO)基因命名委员会批准使用了标准化的基因命名准分子质量DL2000是TaKaRa公司产品。
其它常 符号。
选择16个基因用RT.PCR和cDNA测序验规试剂均按分子克隆手册配制。
证,结果证明均与预测序列一致,其中半数基因是1.2.3引物的合成 具有特定重要功能结构域的高效基因。
根据计算机克隆所得到的编码氨基酸蛋白基因完整eDNA的开放性阅读框架设计5’和3’扩增引 2.1 RT-PCR结果物。
采用Net Primer引物分析软件评价设计引物。
2.1.1 PCR的扩增引物由北京赛百盛公司合成。
C170rf32RT-PCR引 头3批共选择16个基因用RT-PCR均扩增成物覆盖该基因完整ORF,仅不含终止码TAA,即 功,部分核酸电泳图谱如图2。
从ORF终止码TAA开始序列改为GATCCCG,以 如图2所示,SFRSl2的RT—PCR结果电泳分便融合表达进行细胞定位。
析出现单一条带,大小为1 527 bp,与预计大小相1.2.4 PCR反应 符,C170r32的fRT—PCR结果电泳分析出现单一条 采用RT—PCR方法,例如SFRSl2以人类胰腺 带,大小约631 bp,也与预计大小相符。
cDNA文库(Clontech)为模板,C170rf32以 2.1.2重组质粒的构建及酶切鉴定MGC803人胃腺癌细胞系cDNA文库为模板,在 以SFRSl2为例,其重组质粒的构建如图3,PE公司产2400 PCR仪上进行扩增30个循环。
反 将末端带A的PCR产物插入pGEM—Teasy载体的应完毕后取10pL于1%琼脂糖凝胶进行电泳分析,确定后再取10肛L PCR产物用Silica回收亚克隆 多克隆位点的LacZ基因中,获得的重组质粒命名 为pGEM-Teasy-RC508。
该重组质粒经EcolI双酶化。
1.2.5重组测序质粒的构建 切后电泳显示的片段与预计的相符(图4)示。
第二 次测序用NsiI双酶切掉500 bp片段后自连的重组 载体pGEM-T—easy和PCR产物(摩尔比为1:3)用DNA连接试剂盒溶液水浴14~16 h。
质粒(图5),经Ecoll和NsiI双酶切及XbaI单酶切1.2.6测序策略及方法 后的电泳结果与预计的相符(图6)。
再如较小基因 用ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer对 C170rf32,将末端带A的PCR产物插入pGEM-T-C170rf32用T7和Sp6通用引物进行正反向测序。
easy载体的多克隆位点的LacZ基因中,获得的重采取以下策略对SFRSl2进行测评:在508氨基酸 组质粒命名为pGEM-Teasy—RC208。
该重组质粒经蛋白基因ORF的第1 111位有一Nsil的单一酶切 E∞lI双酶切后电泳显示的片段与预计的相符(图2)。
位点,pGEM-Teasy载体的下游多克隆位点127位也有一NsiI的酶切位点。
将10肛L重组质粒用Nsil 2.2测序结果及分析进行双酶切,切掉约500 bp的片段,连接后小量快 用全自动测序仪对pGEM-Teasy-RC508重组速提取质粒DNA进行酶切鉴定,T7单向测序。
质粒进行序列分析,将两次测序结果拼接后1680 bp与计算机克隆RC508 eDNA全长序列3811 bp1.3功能基因组研究 的全程比对结果表明,用RT-PCR从胰脏扩出的包 以蛋白质功能为线索搜寻编码小分子肽类的人 含编码508个氨基酸残基最大开放读码框架(0RF)类功能基因和疾病相关基因。
蛋白质功能结构域或 的cDNA片段与电子克隆结果一致。
人类RC508Motif预测方法同常规。
在北京大学人类疾病基因 eDNA的完整序列的GenBank登记号为pGEM- 生命科学研究Life Science Resea rchTeasy-RC208重组质粒测序分析,测序结果(图7) 经EST数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.与计算机克隆RC208 cDNA全长序列1679 bp的全 gov/BLAST/)比对分析,发现1679 bp C170ff32程比对结果表明,用MGC803人胃癌细胞系扩出的 eDNA全长受人类EST的完全支持,3811 bp包含编码208个氨基酸残基最大开放读码框架 SFRSl2 eDNA只有1121—1408=287 bp和3598—(ORF)的cDNA片段与电子识别结果一致。
人类 3623=26 bp两段无EST支持,其余均受EST完全C170d32 eDNA的完整序列和编码蛋白的氨基酸序 支持。
列的GenBank登记号:AY074907和TPA:BK000260。
共测序16个人类新基因,部分基因测 2.4基因组数据库的检索结果和意义序峰图如图7~9。
2.4.1 C170rf32 C170H32的1679 bp eDNA与人类的17号染2.3 EST数据库的检索结果和意义 色体NT 010808.7完全地(100%)匹配(>reflNT- .
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