.林慧贤等)用已知_summaryhtml)(2001遗传图位的BAC克隆片段筛选水稻小穗eDNA文库,获得1个小GTP结合蛋白的相关序列,以该eDNA序列为基础将4个EST拼接,进行电子克隆,利用RT--PCR的方法得到了1个新水稻小GTP蛋白基因OsrabSB的eDNA克隆。
以来源于水稻盐胁迫eDNA文库的500bpESTS121为信息探针搜索GenBank水稻EST库,发现2个EST与S121部分序列一致,经过拼接组装获得了886bp全长eDNA序列,同源性比较的结果表明其可能编码新的水稻锌指蛋白基因,根据拼接好的序列设计PCR引物,通过RT-PCR方法成功分离了该基因完整的eDNA克隆,命名为OsZFP,该锌指蛋白可能涉及到水稻幼苗的盐胁迫应答反应(黄骥等,2002b).利用基因组信息也有成功克隆基因的报道。
黄骥等(2002c)利用来自小麦的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)eDNA克隆Tagpdl序列为探针,搜索水稻基因组数据库,结果找到1个与之高度同源的水稻相应基因组BAC序列,通过人工序列拼接和RT.PCR首次克隆到了水稻G6PDH的全长eDNA,命名为OsG6PDH(GenBank注册号:AY078072),经分析表明该基因编码的蛋白为胞质G6PDH,是磷酸戊糖的限速酶。
依据不同物种同类基因之间存在序列保守性,唐向荣等(2002)发现2个水稻EST片段与大白菜基因BcpLH的双链RNA结合区(dsRBD)存在同源区域,根据同源片段设计引物,用RT-PCR方法从水稻愈伤组织中扩增得到1.8kb的eDNA片段,该eDNA含有完整的编码区和两个典型的dsRBD,与大白菜BcpLH的dsRBD在氨基酸水平上相似性为75%左右。
在进行基因克隆过程中,利用候选克隆在数据库中进行相似性比较后确定候选基因功能,可以提高预测效果。
水稻抗稻瘟病基因Pi-ta克隆过程中,来自予BACl42E8候选基因克隆序列与拟南芥的序列AL049487和AC类转座酶AC006420具有高度同源性,推测它可能为转座酶编码基因,经转化后的功能鉴定分析验证了上述结论(Bryan等,2000;Orbac等,2000);对水稻基因组5%BAC末端测序结果表明,在水稻基因组内大约有750~1500个编码NBS(NucleotideBindingSite)保守区的基因,多数水稻的抗病基因具有NBS结构,这为发现水稻抗病基因奠定了基础(朱永生和张端品,2002)。
抗稻瘟病基因户曲中来自LOsl47的亚克隆经同源性检索与植物抗病基因的NBS具有高度的同源性,确定为NBS家族的抗病基因(Wang等,1999)。
利用数据库中蛋白质的表达谱,Moons等(1997)比较受盐胁迫和ABA处理下的蛋白图谱,克隆了与抗胁迫有关的胚胎晚期丰富蛋白.分析逆转座子Tosl7插入突变信息,有利于在基因组内大规模鉴定与发掘新功能基因(江树业,2003)。
1.4.3功能基因组学研究功能基因组利用核酸序列提供的信息,高通量地系统分析全基因组的各个基因在控制生殖和发育中的作用及对外界环境刺激的反应(SomervilleCandSomervilleS,1999),包括基因功能发现、基因表达分析及其突变检测(陈彤等,2002).生物信息学将为大6规模数据分析提供技术平台,对特定序列进行基因的结构预测及功能注释,并迅速渗透到基因表达图谱分析、与功能基因组信息相关的核酸、蛋白质的空间结构预测模拟以及蛋白质的功能预测等领域。
(1)EST分析:以EST为标记构建转录图谱时,来源于不同器官的EST为基因功能研究提供了有价值的信息。
Ewing等(1999)在数据库中收集了大量的水稻EST,在全基因组水平根据基因的表达方式进行聚类,结果不同组织和器官行使相同功能的基因或cDNA具有相同的表达模式,利用该表达模式可以进行水稻类似结构未知基因的鉴别和注释。
Mao等(2000)开发出一种序列标签连接体(Sequence??TaggexI-Conncctor,STC)结构,包含高倍覆盖水稻基因组的BAC文库和插入BAC克隆cDNA末端,用FASTA检索73000个STC中的转录因子,其中2746个STC发现与转座因子有同源区域,通过EST比较发现这些结构分布在基因区域附近,该方法为水稻基因组功能基因的预测提供了一种模式。
(2)生物芯片研究:生物芯片(biochip)是指通过微加工技术和微电子技术在固格体芯片表面构建的微型生物化学分析系统,其分析实质是指在基片表面点阵排列了一系列可寻址的识别分子,反应在相同的条件下进行,反应结果用同位素法、化学发光法或酶标法显示,然后用精密的扫描仪或ccD摄像技术记录,通过计算机软件分析,形成可读信息,实现对细胞、蛋白质、DNA以及其他生物组分的准确、快速、大信息量的检测(王景雪等,2004),其技术主要包括芯片方阵的构建、样品的制备、生物反应和信号检测及分析等环节。
信号检测是将芯片置入专用扫描仪中,通过采集各反应点的荧光位置、荧光强弱,再经相关软件分析图像,以快速准确地获取样品中的生物信息。
因此,生物芯片技术中整个检测及分析技术环节都属于生物信息学的研究领域。
(3)基因功能分析:拟南芥和水稻进行大规模的全序列钡0序后,必须对20000至25000个基本基因进行大规模功能分析(黎裕等,2000).目前有3大类方法可用于高质量的基因功能分析工作:①用最大相似的同源基因功能注释咨询序列;②用模体搜索;③用Tatusov等(1997)的直系同源簇方法(ClusterofOrthologousGroup,COG),即用不同种族的基因成对相似聚类法把它们划分成各种直系同源簇,从而可以用同一簇中的已知基因注释未知基因的功能。
基因功能分析还包括基因组各组成基因在序列水平、位置排列的顺序关系;在转录、表达水平,基因产物之间的相互作用。
要想完整地了解基因的功能,必须深入了解这些基因在生物体代谢途径中的地位,并尽可能揭示它7们之间相互调控的机制,目前这方面的工作在植物上还处于起步阶段(Bellgard等,2004:EdwardsandBarley,2004).“)非编码区信息分析:高等真核生物基因组中90%以上是非编码区(Yu等,2002),人类则多达95%-97%;它们大多是具有重要生物功能的片断,参与基因在四维时空的表达调控,揭示其编码特征、调节方式和表达规律,对于全面了解基因组功能、基因调控网络构成及其作用方式具有十分重要的意义(Lazzarato等,2004).随着多细胞真核生物基因组序列测定的顺利进展,非编码区信息结构分析和信息调控规律研究将为生命调控机理研究开辟新的领域,必将成为生物信息学的新热点。
生物信息学在非编码区分析中应用的策略有两种:①基于已知功能DNA元件的序列特征,预测非编码区中可能含有的功能已知DNA元件,进而预测其可能的生物学功能并通过实验加以验证;②通过数理理论探索非编码区功能未知的序列特征,从理论上分析预测其可能的信息含义和功能,再通过实验进行验证(EdwardsandBarley,2004)。
1.4.4比较基因组学研究比较基因组学(ComparativeGenomics)是基于基因组图谱和测序基础上,对已知的基因和基因组结构进行比较,来了解基因的功能、表达机理和物种进化的学科(吴学军和柴建华,2000;Bellgard等,2004)。
随着越来越多的生物基因组计划的完成与DNA芯片技术的发展,比较基因组学得以迅速发展并成为目前生命科学研究领域的热点,而生物信息学的发展则为比较基因组学研究提供了便利的研究手段:(1)全基因组比较:基因组记录着生物进化的全过程,综合利用数据库对不同物种
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