论的基础上,以化学发光信号示踪,建立了化学发光免疫分析(CLIA,Chemiluminesent Immunoassay)技术。
因其具有和RIA相似的灵敏度和特异性,受到国内外学者的重视,并投入了相当的人力和资金对该方法进行研究,并制造测量仪器。
大量的实验结果证明,大津大学硕十论文 第一章绪论 RlA的优点: ·成本底、灵敏度高; · 不受周围环境和样本干扰物质的影响; ·与小颗粒同位索的结合不影响免疫反应和; ·具有完善的放射测量体系; ·但其缺点也是显而易见的: · 同位素的半衰期使货架期短,试剂盒不易储存: ·反应时闻过长,并且反应时间不一,不易实现自动化; · 结合丁抗原或抗体分子上的l”5碘分子数量有限,过高会引起结合物的自照射而分解,影响试剂的使用;购买以.及废物处理等均引起一定的辐射安全问题,虽然RIA涉及的放射性较小,但仍会面临公众的反核的负面的影响;同时.临床医学要求快速诊断的呼声不断增高,使RIA面I擒进一步挑战。
1.2.2化学发光技术的建立l、化学发光技术的定义 化学发光技术是近十几年来发展起来的一种测定方式,利用化学反应释放的自由能激发中间体(常用碱性磷酸酶一金刚烷胺),使其从激发态回到基态,当中间体从激发态回到基态时会释放等能级的光子,通过对光子进行测定而进行定量分析。
化学发光具有荧光的特异性,同时不需要激发光,从而避免了荧光分析中激发光杂散光的影响,有很高的灵敏度;并且不象放射分析那样存在强烈的环境污染和健康危害,是一种非常优秀的定量分析方法。
2、化学发光免疫技术的前身 化学发光免疫技术的前身可以称为酶免疫分析技术,酶作为催化特异反应的一种生物蛋白,由于其催化作用,使反应物得以高度转换,具有很大的放大效应。
酶探测频率颇高,平均~个酶分子一秒内产生一千分子的有色荧光或发光物质。
1966年Avrameas和Uriel首先将酶偶联应用于抗原和抗体;随后在1974年,Syvaco首先报道了EIA分析,即均捌“酶测免疫分析”(EnzymeMonitored Immunoassay),开创了酶免疫分析的临床应用。
虽然酶免疫技术不是真正的化学发光技术,但其为化学发光技术的应用奠定了良好基础。
3、化学发光技术的应用 1978年Schrpeder在RIA和EIA基本理论的基础上,以化学发光信号示踪,建立了化学发光免疫分析(CLIA,Chemiluminesent Immunoassay)技术。
因其具有和RIA相似的灵敏度和特异性,受到国内外学者的重视,并投入了相当的人力和资金对该方法进行研究,并制造测量仪器。
大量的实验结果证明,当的人力和资金对该方法进行研究,并制造测量仪器。
大量的实验结果证明,天泮大学硕十论文 第一章绪论CLIA因光信号持续时间太短,达不到I临床应用水平。
为解决测量方法上的缺点,一些学者进行了发光稳定剂的研究,90年代初首先由英国Amersham公司研究人员发现在HRP催化的Luminol发光反应中加微量对一碘酚,可以使发光信号持续20~30分钟。
随后生产出试剂盒。
标示了化学发光技术进入了临床应用的开端。
4、标准曲线 标准曲线是免疫反应中一个基本概念。
它是一个线性方程式,能够最佳反映CPS信号与待测物浓度之间的相互关系。
每一个批号试剂提供的主标准曲线是在单一仪器上通过下列方式完成的:因分析物和检测范围的不同,选择不同的标准点数量,如T4试剂盒(检测范围1—24ug/dL)设置6个标准点,而TSH(检测范围0.002—75ulU/mL)设置15个标准点;每一个标准点随机选取大数量的复制品进行多次运行,每次运行均同时运行质控血清和低、高浓度校正液的复制品。
绝大多数免疫检测标准曲线都能够与四参数Log/Logit方程式相适应,通过对检测标准物得到每一个标准水平的光信号进行计算,拟和出一条主机CPS信号与待测物浓度相关的曲线,即标准曲线。
计算机运算法则使用公认的曲线适应程序以达到最佳的曲线拟和。
在实际的测量中,待测样本和标记的已知抗原或抗体结合后,促使底物发光,由PMT(光电倍增管)得到发光计数,然后参照标准曲线计算即可得到待测样本的浓度值。
1.3国际主流化学发光免疫分析仪的原理、技术及特点 随着免疫学的不断发展,新的免疫学技术不断出现,如化学发光技术、时间分辨荧光免疫测定技术、荧光偏振免疫分析测定技术等,促进了免疫检测的自动化,一大批先进的自动化免疫分析仪应运而生,它们的出现不仅减轻了工作人员的劳动强度,而且缩短了分析流程,提高了实验结果的精确度和准确性,灵敏度更是达到ng甚至pg水平,在内分泌激素、血浆特种蛋白、肿瘤标志物、维生素、体内药物浓度的快速测定中起着重要作用。
各种现代化免疫分析仪都使用一种或两种新的免疫分析技术,如:酶联免疫分析技术、生物素一亲和素技术、化学发光分析技术、荧光偏振技术、时间分辨荧光免疫测定技术、电化学发光技术等,使免疫检验手段更先进、方法更可靠、结果更准确、可与放射免疫分析技术相媲美。
下面就国内外常见的自动化免疫分析仪采用的分析原理作一介绍。
天津大学硕士论文 第一章绪论1.3,1微粒子捕捉酶免疫分析技术(MEIA) 下面以双抗体夹心法为例介绍微粒子捕捉酶免疫分析技术:已包被了抗体的塑料微珠试剂中,加入待测标本后,经温育,再加入碱性磷酸酶标记的抗体、形成抗体一抗原一酶标记抗体复合物。
然后将其转移到玻璃纤维柱上,P日缓冲液洗涤,没有结合的抗原、酶标抗体被洗掉,结合抗原抗体的塑料微珠则被保留在纤维柱滤膜的上方。
这时再加入底物,4.甲基伞型酣磷酸盐(4一Mup)。
酶标抗体上的碱性磷酸酶将4Mup分解,脱磷酸后形成甲基伞型酣(4Mu),在365nm激发光的照射下,发出448nm的荧光,经过荧光读数仪的记录、放大,计算出所测物质的含量。
1.3.2荧光偏振免疫分析技术(FPIA) 这是一种均相荧光免疫分析法,主要用于测定小分子量物质,如药物浓度测定。
原理是:标记在小分子抗原上的荧光素经485nm的激发偏振光照射后,吸收光能,越入激发状态,激发状态的荧光素不稳定,很快以发出光子的形式释放能量而还原。
发射出的光子经过偏振仪形成525~550nm的偏振光,这一偏振光的强度与荧光素受激发时分子转动的速度呈反比,游离的荧光素标记抗原,分子小,转动速度快,激发后发射的光子散向四面八方,因此通向偏振仪的光信号很弱,而与抗体大分子结合的荧光素标记抗原,因分子大,分子的转动慢,激发后产生的荧光比较集中,因此偏振光信号比未结合时强得多。
在测定过程中待测抗原小分子、荧光标记抗原小分子和特异性抗体大分子同时加入到一反应杯中,经过温育,待测抗原和荧光标记抗原竞争性地与抗体结合,待测抗原越少,与抗体竞争结合的量越少,而荧光标记抗原与抗体结合量就越多,当激发光照射时,荧光偏振的程度与荧光标记物分子转动的速度成反比,而荧光标记的小分子抗原与大分子抗体结合后,其分子的转动速度减慢,因此荧光偏振信号强。
结果是待测抗原的浓度低,可以通过计算获得其含量。
1.3.3利用化学发光技术和磁性微粒子分离技术相结合 此方法以吖啶酶为发光的标记物,固相载体为极细小的磁性颗粒。
其测定原理与放射免疫和酶联免疫中的双抗体夹心法和竞争结合法相似。
1.3.4采用酶联免疫技术、生物素亲和素技术和增强化学发光技术 此方法是用辣根过氧化物酶(HRP)标记抗原或抗体、以子弹头型塑料小孔管为固相载体,鲁
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