No. 30327001. II 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。
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(请在以上方框内打“√”)学位论文作者签名: 指导教师签名:日期: 年 月 日 日期: 年 月 日 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 1 绪 言1.1 引言 电生理学是生理学的一部分,它主要研究活组织的生物电现象和电流对活组织所产生的生理影响。
电生理学技术和概念始于1791年Galvani的一次青蛙实验,至今已达2个世纪之久,在这漫长的发展历程中,总共经历了起始时期、电流计时代、示波器时代、微电极时代和膜片钳时代五个历史阶段1。
起始时期,由英国的Stephen Gray最早提出人体可以带电,法国人Charles Francois du Fay做了很多人体实验,进一步确定了人体可以带电;在电流计时代,发现活组织本身就存在生物电,电生理学技术也开始应用于临床;示波器时代,Erlanger与Gasser 合著的《神经活动的电表现 Electrical signsof nervous activity》一书,是应用阴极射线示波器研究外周神经活动的一个总结,他们两人因此而获得l944年的诺贝尔生理学或医学奖。
从此以后生理学的研究开始进入电生理时代。
到1939年,Cole、Curtis、Hodgkin、Huxley首先成功的进行了乌贼巨轴突的内记录,揭开了细胞内记录技术的新篇章,开始进入微电极时代。
微电极细胞内记录动作电位的技术迅速传播,中枢神经系统的电生理研究也面目为之一新。
1976年由Neher和Sakamann共同创立了一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜上单一的或多个的离子通道分子活动的技术2,就是膜片钳技术。
膜片钳技术为细胞生理学的研究带来了一场革命性的变化,给生命科学研究带来了巨大的前进动力。
1.2 膜片钳技术发展史 膜片钳技术是在电压钳基础上发展起来的。
传统的电压钳一般为双电极电压钳,电压钳的实质是通过负反馈微电流放大器在兴奋性细胞膜上外加电流,保持细胞跨膜电位不变,并迅速控制其数值,以观察在不同膜电位条件下膜电流的情况。
膜电流的改变反映了膜电阻和膜电容的变化,因此电压钳可用来研究整个细胞膜或一大块细胞 1 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文膜上所有离子通道的活动。
但该技术由于需要在细胞内插入两根电极,对细胞损伤很大,在小细胞中难以实现,又因细胞形态复杂,很难保持细胞膜各处生物特性的一致。
膜片钳技术patch-clamp与电压钳的主要区别有二:一是钳制膜电位的方法不同,二是电位固定的细胞膜面积不同,即所研究的离子通道数目不同2。
膜片钳是利用负反馈电路,将微电极尖端所吸附的一个至几个平方微米的细胞膜电位固定在一定电平,观察流过通道的离子电流。
其实现膜电位固定的关键是在玻璃微电极尖端边缘与细胞膜之间形成高阻封接,使电极尖开口处与相接的细胞膜小区域膜片形成无论是从机械上还是电学上都极为紧密地封接,从而可反映细胞上单一或多个离子通道的分子活动3。
膜片钳放大器结构如图1.1。
电路由高增益集成运放A1和A2组成。
A1与反馈电阻Rf组成电压负反馈电路,A2组成单位增益差分电路。
根据负反馈放大电路的原理,A1的两输入端之间形成“虚短”和“虚断”的现象。
当A1同相输入端加入命令电压Vc,可使细胞膜钳位于Vc。
命令信号源电路并不影响被测细胞的活性状态,符合生物测量要求2。
图1.1 膜片钳放大器基本原理 膜片钳记录技术有如下优点:①最主要的是在G封接形成的结果