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创新实验报告之 大肠杆菌碱性磷酸酶基因AKP的克隆与表达 大肠杆菌碱性磷酸酶基因AKP的克隆与表达 【摘要】 目的克隆大肠杆菌碱性磷酸酶基因AKP片段构建原核表达载体pET-28a并在原核细胞中表达。
方法根据AKP序列设计特异性引物进行PCR扩增目的基因AKP从BamH Ⅰ和Hind Ⅲ 酶切位点克隆入原核表达载体 pET-28a将连接产物转化大肠杆菌挑出阳性克隆IPTG诱导表达重组的融合蛋白。
结果PCR获得的AKP序列约为1500bp重组载体在大肠杆菌中高效表达在相对分子质量约55KDa处有特异的蛋白条带。
结论为进一步研究大肠杆菌碱性磷酸酶的结构与功能打下基础。
【关键词】大肠杆菌碱性磷酸酶AKPPCR表达 碱性磷酸单酯酶Alkaline Phosphatase EC3.1.3.1又称碱性磷酸酯酶、碱性磷酸酶。
大肠杆菌碱性磷酸酶E.coli alkaline phosphataseEAPEC 3.1 3.1是同二聚体金属酶能催化非特异性磷酸单酯水解分子量是56KDa1。
它是一个同源二聚体金属酶每个单体由449个氨基酸、两个Zn2和一个Mg2组成分别位于两个单体上的两个活性中心相距3nm可以看作是由Asp101-Ser102-Ala103 催化三联体、3个金属离子和它们的配体、一些水分子以及Arg166组成2。
自AKP分离纯化及其全部基因获得以来3-4它一直作为研究磷酸酶催化机制、蛋白质折叠等的模型蛋白也作为生化和分子生物学等研究领域的工具酶以及相关疾病的临床诊断指标5-6。
而EAP最易操作和获得所以被作为AP的模型得到最为充分的研究。
EAP可有效地清除寡聚核糖核苷酸和寡聚脱氧核糖核苷酸末端的单酯化磷酸7。
它还可作为一种工具在表位连锁图谱、组织化学、免疫印迹、突变分析等方面有广泛应用8为此本研究对大肠杆菌碱性磷酸酶基因AKP进行克隆与表达为将来研究这种酶的结构和功能打下坚实的基础。
1 材料和方法 1.1 材 料 1.1.1 菌种和质粒 受体菌株E.coli DH5α、表达菌株E.coli BL21DE3、克隆载体pET28a均由本实验室保存提供。
1.1.2 引物 phoA-P1:5’ GTCGCGGATCCATGTCACGGCCGAGAC3’BamHⅠ phoA-P2:5’ GCGACAAGCTTTATTTCAGCCCCAGAG3’Hind Ⅲ 1.1.3 主要试剂 Taq DNA Polymerase BamH I Hind III Buffer AT4-DNA ligase卡那霉素、LB液体培养基琼脂糖溶液I溶液Ⅱ溶液Ⅲ酚氯仿无水乙醇RTE回收试剂盒 10SDS溶液10过硫酸铵溶液过硫酸铵溶液30丙烯酰胺考马斯亮蓝染色液脱色液pH7.4PBSkanaIPTG等。
1.1.4 仪器 超净工作台水浴锅冰箱离心机摇床电泳仪PCR仪紫外透射分析仪GIS数码凝胶图象处理系统高压蒸汽灭菌锅培养皿培养箱试管试管架烧杯三角锥形瓶玻璃棒震荡仪移液枪枪头EP管酒精灯等。
1.2 方 法 1.2.1 碱性磷酸酶基因AKP的扩增及回收 1.2.1.1 PCR扩增目的基因 DNA模板引物均由本实验室提供按照下表所列体系进行PCR扩增AKP基因50L体系 表1 碱性磷酸酶基因PCR扩增反应体系 反应体系 体积 10mM dNTP Mixture 2L 10xbuffer Mg2 5L 10uM 引物1sense 1L 10uM引物2anti-sense 1L 模板DNA 1L MgCl225mM 4L ddH2O 35L Ex-Taq1U 1L total 50L PCR反应程序为94℃ 5min后按以下方式进行扩增 94℃ 30s55℃ 30s72℃ 90s为一个循环条件运行30个循环后再于72℃延伸7min结束。
PCR产物置于4℃保存。
2Agarose1 × TAE电泳检测PCR产物浓度。
1.2.1.2 回收PCR产物 本实验采用AxyPrep PCR清洁试剂盒回收在PCR反应液中加入3倍体积的Buffer A若Buffer A不足100L加至100L混匀后转移到DNA制备管中将DNA制备管置于2mL离心管中12000rpm离心1min弃滤液。
将DNA制备管放回2mL离心管加0.7mL Buffer W212000rpm离心1min弃滤液。
将DNA制备管放回2mL离心管加0.4mL Buffer W212000rpm离心1min弃滤液。
将DNA制备管放回1.5mL离心管在DNA制备膜的正中央加25-30L Eluent室温静置1min12000rpm离心1min洗脱DNA。
用1×TAE溶液配制2的琼脂糖凝胶然后放入电泳槽倒满TAE缓冲液上样通电50V跑100min紫外灯下观察并拍照。
1.2.2 质粒pET-28a的提取 将含质粒pET-28a的单菌落接入含kan50g/mL的3mL LB液体培养基中37℃振荡培养过夜取菌液到1.5mlEP管中室温下10000rpm离心2min去上清收集沉淀向管中加入100L溶液I充分重悬菌体再加200L溶液II轻轻反复颠倒混匀室温放置1min裂解至菌液变清加入200L溶液III反复颠倒混匀静置5min10000rpm离心5min小心取出上清置于另一EP中上清中加入等体积酚氯仿11剧烈振荡混匀12000rpm离心10min上清中加入2倍体积无水乙醇剧烈振荡混匀室温放置15min沉淀DNA。
12000rpm离心10min弃上清。
沉淀用1mL 75乙醇洗两次每次12000rpm离心5min沉淀充分干燥后加入40uL RTETE中含有20ug/mL的RNase温和振荡几秒钟20℃保存取5uL进行2Agarose电泳检测纯化的质粒载体。
1.2.3 PCR产物和质粒载体的双酶切反应 在灭菌的1.5mL EP管中按照表2所列体系准备双酶切反应 表2 酶切反应体系20L体系 管号 核酸 10 × bufferK ddH2O BamH I Hind III Tube1 Tube2 15L AKP 12L pET-28a 2L 2L 0L 3L 2L 2L 1L 1L 37℃水浴三小时后分别在酶解液中加入1/10体积的3mol/L NaAc pH5.2溶液再加2倍体积的无水乙醇20℃冰箱静置30分钟12000 rpm4℃条件下离心15分钟弃去上清向沉淀加75乙醇300L用以洗涤沉淀再在12000rpm4℃条件下离心15分钟弃去上清真空干燥后向管内加5L TE溶解沉淀2Agarose电泳检测酶切质粒和外源DNA基因的相对浓度按连接反应体系混合酶切后的2个DNA片段14℃保温14小时并做转化实验 1.2.4 酶切产物质粒载体和AKP的连接 在灭菌的0.5mL管中按表3准备连接反应体系10L体系 表3 连接反应体系 AKP pET-28a 10 x ligase buffer T4 DNA ligase ddH2O XL YL 1L 1L ZL pET-28a和AKP的相对浓度约为13 - 110总体积为10L。
14℃恒温水浴过夜。
1.2.5 感受态细胞与连接产物的转化 挑取一个DH5α单菌落于3mL LB培养基中37℃180rpm 培养过夜取0.04mL过夜培养物加入到4mL LB无Kan培养基中37℃200rpm培养至OD6000.4-0.5大约2.5小时取培养物置于1.5mL的灭菌离心管中冰浴10min4000rpm4℃离心10min弃上清菌体重悬于1mL 100mmol/mL冰冷CaCl2中4℃ 30min4000rpm离心5min弃上清菌体重悬于2mL 100mmol/mL冰冷的CaCl2中用于转化向5L连接产物中加入200L感受态细胞阴性对照200L感受态细胞5 L无菌双蒸水阳性对照200L5L 酶切前的质粒冰浴30min热激 42℃90秒冰浴2min加入800L无抗生素的 LB液体培养基37℃150rpm 复苏1h将菌液全部涂板培养。
将平皿放置37℃温箱30分钟至液体被吸收。
倒置平皿37℃培养12-16小时出现菌落。
1.2.6 重组子的酶切鉴定 将含重组子的白色单菌落接入3mL含Amp50g/mL的LB液体培养基中37℃振荡培养过夜。
提取质粒DNA。
双酶切质粒DNA10L体系。
2琼脂糖凝胶电泳检测重组质粒和它的酶切产物。
1.2.7 高效表达菌珠的构建 方法同1.2.6但DH5α菌株换为BL21菌株。
1.2.8 高效表达菌AKP蛋白诱导表达及SDSPAGE检测 将一个单一高效表达菌落到3mL含Kan的无菌LB培养基中37℃、190rpm振荡培养过夜。
取1mL预培养液加入到含Kan的50mL无菌LB培养基37℃、250rpm振荡培养3小时至OD6000.7-0.8加入5mL IPTG诱导AKP蛋白表达。
分别在加入IPTG以后0h、1h、2h、3h、4h、5h、6h时取1mL样品到1.5mL EP管中将各个样品12000rpm4℃离心5min去上清加1mL ddH2O重悬离心去上清重复一次。
最后沉淀重悬于100L ddH2O10L与等量1×SDS-PAGE loading buffer混合煮沸10min取10L进行SDS-PAGE蛋白电泳检
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